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ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))是一種高靈敏、高特異的免疫檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物研究和食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域。ELISA試劑盒通常包含預(yù)包被板、檢測(cè)抗體、酶標(biāo)記物、底物、終止液等組分，其測(cè)定方法主要包括直接法、間接法、夾心法(雙抗體夾心)和競爭法。
1. ELISA試劑盒的常見測(cè)定方法
(1) 雙抗體夾心法(Sandwich ELISA)
適用對(duì)象：大分子抗原(如蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、病毒顆粒)
原理：
包被抗體：微孔板預(yù)包被捕獲抗體(Capture Antibody)。
加樣本：待測(cè)抗原與捕獲抗體結(jié)合。
加檢測(cè)抗體：酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體(Detection Antibody)與抗原另一表位結(jié)合。
顯色：加入底物(如TMB)，酶催化顯色，OD值測(cè)定。
特點(diǎn)：
高靈敏度(可檢測(cè)pg/mL級(jí))。
需抗原至少有兩個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)(不適用于小分子)。
(2) 間接法(Indirect ELISA)
適用對(duì)象：抗體檢測(cè)(如血清抗體、疫苗效價(jià)評(píng)估)
原理：
包被抗原：微孔板包被已知抗原。
加樣本：待測(cè)抗體(如血清)與抗原結(jié)合。
加二抗：酶標(biāo)記的二抗(如HRP-抗人IgG)與一抗結(jié)合。
顯色：加入底物，測(cè)定OD值。
特點(diǎn)：
適用于多種抗體檢測(cè)(只需更換包被抗原)。
信號(hào)放大效果強(qiáng)(因二抗可結(jié)合多個(gè)酶分子)。
(3) 競爭法(Competitive ELISA)
適用對(duì)象：小分子抗原(如激素、藥物、毒素)
原理：
包被抗原/抗體：微孔板包被抗原或抗體。
加樣本+酶標(biāo)抗原：待測(cè)樣本與酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合抗體。
顯色：樣本中抗原越多，酶標(biāo)抗原結(jié)合越少，信號(hào)越低(負(fù)相關(guān))。
特點(diǎn)：
適用于半抗原(如農(nóng)藥殘留)。
結(jié)果需反向解讀(OD值越低，樣本濃度越高)。
(4) 直接法(Direct ELISA)
適用對(duì)象：快速檢測(cè)(如病毒抗原篩查)
原理：
包被抗體：微孔板包被捕獲抗體。
加樣本：待測(cè)抗原結(jié)合。
加酶標(biāo)抗體：直接使用酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體(無二抗步驟)。
顯色：測(cè)定OD值。
特點(diǎn)：
步驟簡單，但靈敏度較低。
適用于高濃度抗原檢測(cè)。
2. ELISA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵要求
(1) 樣本處理要求
血清/血漿：避免溶血(血紅蛋白會(huì)干擾顯色)，離心后取上清。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：去除細(xì)胞碎片(離心10,000 ×g，5分鐘)。
組織勻漿：需裂解、離心，取澄清上清。
保存條件：短期4°C，長期-80°C(避免反復(fù)凍融)。
(2) 試劑準(zhǔn)備要求
平衡至室溫：所有試劑使用前需平衡(避免冷凝水影響濃度)。
避免污染：不同試劑使用專用槍頭。
稀釋比例：嚴(yán)格按說明書操作(如1:100稀釋血清)。
(3) 反應(yīng)條件控制
孵育時(shí)間：37°C 1小時(shí)或4°C過夜(延長孵育可提高靈敏度)。
洗滌次數(shù)：通常3-5次(殘留洗滌液會(huì)導(dǎo)致高背景)。
顯色時(shí)間：TMB顯色10-30分鐘(過長會(huì)飽和)。
(4) 儀器要求
酶標(biāo)儀：選擇適配波長(如TMB→450 nm，OPD→492 nm)。
移液器校準(zhǔn)：確保加樣精度(誤差<5%)。
3. 常見問題及解決方案
問題可能原因解決方案
信號(hào)弱/無信號(hào)抗體失效、孵育時(shí)間不足更換抗體，延長孵育時(shí)間
背景高封閉不充分、洗滌不增加封閉劑濃度，加強(qiáng)洗滌(如5次)
孔間差異大加樣不均、氣泡干擾使用多通道移液器，離心去除氣泡
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差稀釋錯(cuò)誤、酶標(biāo)板邊緣效應(yīng)重新稀釋樣本，避免使用邊緣孔
4. 結(jié)果分析與數(shù)據(jù)解讀
標(biāo)準(zhǔn)曲線：用已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品繪制(通常4-5參數(shù)擬合)。
計(jì)算濃度：根據(jù)樣本OD值代入曲線方程。
質(zhì)量控制：
空白孔(Blank)：僅加緩沖液，OD應(yīng)接近0。
陰性對(duì)照(NC)：應(yīng)低于Cut-off值。
陽性對(duì)照(PC)：應(yīng)在預(yù)期范圍內(nèi)。
5. 總結(jié)
選擇合適方法：大分子用夾心法，小分子用競爭法，抗體檢測(cè)用間接法。
嚴(yán)格操作流程：控制孵育時(shí)間、溫度、洗滌次數(shù)。
數(shù)據(jù)驗(yàn)證：每次實(shí)驗(yàn)需包含標(biāo)準(zhǔn)曲線和對(duì)照。
注：以上資料僅供參考，不作為實(shí)驗(yàn)依據(jù)，如需完整版產(chǎn)品信息請(qǐng)咨詢品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師。
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